Enzymová kinetika, kinetika enzymových reakcí

Enzymová kinetika

Faktory ovlivňující enzymové reakce

Všechny reakce, včetně enzymových, jsou do jisté míry vratné. V živých buňkách se reverzibilita ve skutečnosti v mnoha případech neuplatní, protože reakční produkty jsou většinou velice rychle odstraňovány dalšími navazujícími reakcemi. Tok metabolitů v živé buňce je obdobou toku vody v potrubí. Ačkoliv může voda v potrubí téct oběma směry, ve skutečnosti je obvykle tok jednosměrný (ať z důvodů spádu nebo třeba vlivem působení čerpadla). Enzymové reakce se uskutečňují v určitém prostředí, proto jsou ovlivňovány zejména fyzikálně-chemickými vlastnostmi tohoto prostředí.

Koncentrace substrátu má ve většině případů pozitivní efekt na průběh reakce. Čím vyšší je koncentrace substrátu, tím více je reakce stimulována. V okamžiku saturace enzymu substrátem však dalším zvyšováním koncentrace substrátu nelze reakci urychlovat.

Koncentrace protonů ovlivňuje disociační stav jak samotného substrátu a reakčního produktu, tak především funkčních skupin v aktivním centru enzymu. Ovlivňuje i stabilitu enzymu. Enzymy jsou proto schopné katalyzovat reakci jen při určité koncentraci protonů, tedy jen v určitém rozmezí hodnot pH. Závislost aktivity enzymu na pH má obvykle gaussovo rozložení a proto enzym vykazuje maximální aktivitu v relativně úzkém rozmezí hodnot pH. Tato oblast se označuje jako optimální rozmezí pH pro daný enzym, někdy se vztahuje přímo ke konkrétní hodnotě pH. Obvykle se však uvádí rozmezí hodnot pH, kdy se s 95%ní pravděpodobností dosáhne jeho maximální aktivity.

Na průběh enzymových reakcí má velký vliv teplota. Se zvyšující se teplotou se obvykle zvyšuje i rychlost reakce, ale současně dochází i k rychlejší degradaci molekul enzymu (tepelná denaturace). Naopak při snižování teploty se obvykle zvyšuje viskozita prostředí, což vede ke zpomalení difuze substrátu i reakčního produktu. Také energie molekul se snižuje a tím se také snižuje počet efektivních srážek (menší počet molekul, jejichž energie stačí k překonání energetické bariéry pro danou reakci). Pro většinu enzymů je optimální teplota v rozmezí 25 až 40°C.

Koncentrace iontů obvykle ovlivňuje enzymovou aktivitu tak, že dochází vlivem působení solí k ovlivnění hydratace bílkovin. Stupeň hydratace je přímo odpovědný za rozpustnost dané bílkoviny a také za její stabilitu v roztoku. Koncentrace iontů také ovlivňuje hodnotu redoxního potenciálu prostředí, který má vliv na stav a reaktivitu funkčních skupin v molekule enzymu. Týká se to především -SH skupin, které jsou nejvíce odpovědné za prostorovou strukturu enzymu a mnohdy také za dění v aktivním centru.

Existuje také skupina látek, které nějakým způsobem zvyšují rychlost enzymové reakce, zvyšují stabilitu molekuly enzymu, umožňují tvorbu vazeb mezi molekulou enzymu a molekulou substrátu, nebo mohou vyvolat změnu neaktivní formy enzymu na aktivní formu. Takové látky se označují jako aktivátory. V organismu tuto roli sehrávají různé anorganické ionty. Například ionty Mg²⁺ vyžaduje fosfopyruváthydratáza nebo fosfoglukomutáza, ionty Ca²⁺ zase amyláza nebo lipáza. Jsou známé i enzymy, které pro dosažení plné aktivity potřebují přítomnost i několika různých iontů, příkladem může být argináza, která je aktivována ionty Co²⁺, Mn²⁺ a Ni²⁺. Dalším takovým enzymem je již zmíněná fosfoglukomutáza, která vedle iontů Mg²⁺ vyžaduje ještě přítomnost iontů Mn²⁺ a Co²⁺. Některé kationty jsou natolik pro daný enzym specifické, že nemohou být nahrazené jinými. U jiných enzymů není tato specificita tak vyhraněná a proto mohou být zaměněny za jiné (například Mg²⁺ za Mn²⁺).

Naproti tomu existuje skupina látek, které na enzym působí inhibičně. Inhibitory tedy snižují nebo úplně ruší katalytickou aktivitu enzymu. Buď reagují s některou důležitou složkou prostetické skupiny, nebo s reaktivními skupinami bílkovinné části enzymu. Například formaldehyd se váže na volné aminokyseliny a tím mění prostorovou strukturu apoenzymu. Inhibitory se mnohdy vytváří během metabolismu živin a hrají důležitou roli v regulaci enzymové aktivity.

Reakční rychlost

Chemickou kinetikou se rozumí nauka o reakčních rychlostech. Kinetická teorie (také označovaná jako teorie srážek) říká, že pokud mají spolu molekuly reagovat, musí se navzájem srazit a současně musí mít dostatečnou energii, aby překonaly energetickou bariéru nutnou k proběhnutí reakce. Za srážku se považuje takový děj, který vede k přiblížení molekul na vzdálenost odpovídající délce chemické vazby. Reakční rychlost je tedy zvyšována vším, co jakýmkoliv způsobem zvyšuje kinetickou energii reagujících molekul, snižuje energetickou bariéru reakce, případně zvyšuje i frekvenci srážek reagujících molekul.

V případě enzymů lze reakční rychlost považovat za pomyslnou míru množství a účinku enzymu. Reakční rychlost se obvykle definuje jako přeměna množství látky za časovou jednotku, pro enzymové reakce se nejčastěji uvádí jednotka µmol/minutu. Toto označení není úplně správné, protože rychlost enzymové reakce má jednotku mol/l . s (mol na litr a sekundu). Zkrácené uvádění mol za čas vychází z předpokladu, že se hodnota vztahuje na 1 litr roztoku. Pokud je tedy rychlost reakce uváděna jako µmol/minutu, týká se uvedená hodnota automaticky objemu 1 litr.

Aktivita enzymu se vyjadřuje v jednotkách aktivity na 1 mg bílkoviny. 1 mezinárodní jednotka (IU) je takové množství enzymu, které katalyzuje tvorbu 1 µmol produktu za 1 minutu při standardních (optimálních) podmínkách. Podle nových pravidel se užívá jednotka katal (kat), což je množství enzymu, které přemění 1 mol substrátu za sekundu. V praxi se však stále používají i mezinárodní jednotky (IU). Odvození Michaelisovy konstanty a rovnice pro výpočet rychlosti enzymově katalyzované reakce je uvedeno v dalším textu.

Reakce prvního řádu

Mnoho reakcí probíhá podle schématu, kdy se látka S (substrát) přeměňuje na látku P (reakční produkt). Rychlost této přeměny je úměrná koncentraci substrátu. Předpokladem ovšem je, že nedochází k žádné vzájemné interakci mezi substrátem a produktem. Příkladem takové reakce je radioaktivní rozpad. V mnoha případech je právě rozklad komplexů enzym-substrát právě příkladem unimolekulárního procesu. Často jsou reakce prvního řádu pseudounimolekulárními. Látka S reaguje s jinou molekulou, která je ale ve velkém nadbytku a proto se během reakce nijak nemění její koncentrace (příkladem takové druhé látky může být voda). Potom i v tomto případě je rychlost reakce závislá pouze na množství látky S.

Rychlost reakce v má rozměr mol.l^-1.s^-1. Koncentrace substrátu nebo produktu je v mol.l^-1.
Reakční čas t je v jednotkách času (s, v enzymologii se nejčastěji pracuje s minutami), rychlostní konstanta k je v s^-1.

Reakce druhého řádu

Reakce dvou substrátů (takto může být i chápána reakce enzymu a substrátu - takto uvedeno i na následující tabuli) je charakterizována rychlostní konstantou druhého řádu.

Takto definovaná rychlostní konstanta má rozměr mol.l^-1.s^-1. Pokud však koncentrace některého ze substrátů bude rovna 1, pak bude mít rychlost reakce číselně stejnou hodnotu, jako v případě reakce prvního řádu. V mnohých reálných systémech bývá jeden ze substrátů (např. B) ve výrazném nadbytku, jeho koncentrace se během reakce nemění a v takovém případě je experimentálně stanovená reakční rychlost rovna k.[B].

Rovnice Michaelise a Mentenové

Základním faktorem, který ovlivňuje rychlost reakcí katalyzovaných enzymy je změna koncentrací reakčních partnerů. V počáteční fázi reakce, tedy v okamžiku, kdy téměř žádný substrát ještě nezreagoval s enzymem, určuje rychlost reakce koncentrace enzymu. Tento stav je rozhodující pro charakterizaci enzymu z hlediska jeho katalytické účinnosti. Velký význam má koncentrace substrátu. Uvažujme v modelovém příkladu molekulovou hmotnost enzymu 100.000 a molekulovou hmotnost substrátu např. 100. Při tomto modelovém pokusu je do roztoku přidán enzym v množství 1 µg/ml, substrátu pak 1 mg/ml. Koncentrace enzymu je tak 10^-8 M, koncentrace substrátu 10^-2 M. Na 1 molekulu enzymu tak připadá 10⁶ molekul substrátu. I když během reakce bude docházet k přeměně substrátu na produkt a tím se bude jeho koncentrace snižovat, stále i při stonásobném poklesu jeho koncentrace bude jeho nadbytek vůči enzymu obrovský (10.000x více). Rychlost reakce je tedy výsledkem rychlosti saturace molekul enzymu molekulami substrátu, a ta je logicky tím vyšší, čím větší bude počet efektivních útoků molekul substrátu na molekulu enzymu. Čím více molekul substrátu ve srovnání s molekulami enzymu v roztoku bude, tím větší počet molekul substrátu bude mít snahu narazit do aktivního centra enzymu (saturovat ho) a tím je i vyšší pravděpodobnost uskutečnění reakce.

Z uvedeného je patrné, že rychlost reakce bude úměrná stupni saturace molekuly enzymu substrátem. Na uvedeném grafu symbolizují body A a B stav, kdy není všechen přítomný enzym plně saturován substrátem, přestože je molekul substrátu mnohem více, než molekul enzymu. V bodech A a B tedy jakákoliv změna v koncentraci substrátu vyvolá poměrně výraznou změnu ve stupni saturace enzymu substrátem. Naproti tomu v bodě C (enzym téměř zcela saturován) vyvolá stejná změna v koncentraci substrátu jen velice nepatrnou změnu v reakční rychlosti. A to i přesto, že zvýšení koncentrace substrátu zvyšuje počet efektivních srážek s enzymem. Zvýšení rychlosti reakce v bodě C není možné z prostého důvodu - není k dispozici téměř žádná volná molekula enzymu k reakci. Na grafu jsou záměrně uvedeny 2 rozdílné reakce, aby bylo patrné, jakou roli hraje Michaelisova konstanta.

Kinetický model podle Michaelise a Mentenové vychází z předpokladů, že mezi substrátem, volným enzymem a komplexem enzym-substrát se ustavuje rovnováha, produkt reakce (P) je z reakce neustále odčerpáván (jedná se tedy o nevratnou reakci) a enzym se vyskytuje pouze ve formě E nebo ES.

Vysoká hodnota Michaelisovy konstanty znamená, že je nutná vysoká koncentrace substrátu, aby se dosáhlo polovičního nasycení (saturace) enzymu. V takovém případě nemá enzym k příslušnému substrátu velkou afinitu. Michaelisovy konstanty se většinou pohybují v rozmezí hodnot 10^-2 až 10^-6 mol . l^-1.

Pro odvození rovnice pro stanovení rychlosti enzymové reakce je třeba vyjít z následujících skutečností. Při dosažení maximální rychlosti V_max je všechen enzym ve stavu ES (pro větší názornost je na následujícím obrázku uvedeno jako E_t). Při dosažení právě poloviční hodnoty maximální rychlosti je rovnovážná konstanta reakce považována za Michaelisovu konstantu (K_M). Současně lze v tomto stavu vyjádřit aktuální koncentraci enzymu jako rozdíl E_t a ES (podíl enzymu vázaného do komplexu enzym-substrát za daných podmínek).

Závislost podle Lineweavera a Burka

Určit hodnotu V_max je vzhledem k hyperbolickému průběhu grafu prakticky nemožné (nelze přesně určit, při jaké koncentraci substrátu se vlastně dosáhne maximální reakční rychlosti). Z důvodů určitého zjednodušení a hlavně upřesnění stanovení K_M bylo navrženo několik modelů. Nejčastěji používaným je úprava podle Lineweavera a Burka, který pracuje s recipročními hodnotami. Takto vypočítaná Michaelisova konstanta je dynamickou veličinou a podílí se na ní také rychlostní konstanta k₃. Proto se rozeznává substrátová konstanta K_S definovaná podle následujících vztahů. Je-li k₃ velmi malá (rychlost celkové reakce je určována reakcí popsanou pro v₃ a platí předpoklady, které uvažovali Michaelis a Mentenová), pak může být k₃ proti k₂ zanedbána a K_S a K_M vyjdou numericky stejné. Takto je tomu u většiny enzymových reakcí.

Pokud se graficky vynesou veličiny 1/v a 1/[S], pak lze závislost chápat jako rovnici přímky. Směrnice přímky a úseky na osách pak dovolují graficky určit K_M i V_max.

Závislost podle Eadie a Hopstee

Při tomto způsobu stanovení se rovnice formuluje tak, aby se opět dosáhla přímková závislost. Na osu y se vynáší v/[S], na osu x pak hodnoty v. Úsek, který pak přímka vytíná na ose y odpovídá hodnotě V_max/K_M, na ose x pak hodnotě V_max.

Číslo přeměny

Tato hodnota udává počet molekul substrátu, které přemění za jednu minutu jedna molekula enzymu. Vyjádřeno v molárních koncentracích, jde o počet molů substrátů na mol enzymu (molární aktivita). Pro stanovení čísla přeměny musí být známa molekulová hmotnost enzymu a použitý enzym musí být ve vysoce čistém stavu, aby bylo možné přesně stanovit jeho aktivitu. Vysoké číslo přeměny znamená, že reakce probíhá velice rychle. Obvykle se hodnota pohybuje v rozmezí 10³ až 10⁴ molekul substrátu na molekulu enzymu za minutu. Jsou známy enzymy, jejichž číslo přeměny dosahuje až hodnot 10⁶ (např. kataláza nebo acetylcholinesteráza).

Související články

Katalýza - biochemie

Biokatalyzátory - biochemie

Enzymová kinetika při inhibici - biochemie

Regulace enzymové aktivity - biochemie

Odkazy

Při zpracovávání textů a grafické stránky článků byly využity podklady z odborné literatury a internetu. Převzaté obrázky byly graficky upraveny pro potřeby tohoto webu. Kreslené obrázky podléhají autorským právům. Seznam použité literatury naleznete zde.

Zajímavé stránky

wikipedie