Kompetitivní, nekompetitivní, inhibice, inhibitor
Enzymová kinetika při inhibici
Rozlišení inhibitorů
Inhibitory lze rozdělit pomyslně na kompetitivní a nekompetitivní inhibitory. Závisí na tom, zda lze inhibiční vliv eliminovat zvýšenou koncentrací substrátu. Ve skutečnosti však čistě kompetitivních nebo čistě nekompetitivních inhibitorů moc není. Také lze inhibitory roztřídit pole toho, na kterém místě působí. Některé se vážou na enzym na tomtéž místě, jako substrát, jiné se naopak vážou na místě odlišném od vazebného místa pro substrát (alosterické místo).
Kompetitivní inhibice
Klasická kompetitivní inhibice se uskutečňuje na stejném vazebném místě, kde se váže i substrát. Působení kompetitivního inhibitoru lze popsat podle následujícího schématu. Ve skutečnosti se měří rychlost tvorby produktu, která závisí pouze na koncentraci komplexu enzym-substrát. Experimentálně se měří reakční rychlost při konstantní koncentraci inhibitoru a v sérii odstupňovaného množství substrátu.
Při odvozování rovnice pro výpočet rychlosti se vychází z předpokladu, že se inhibitor váže na enzym velmi pevně (KI je číselně malá). Rychlost přeměny komplexu enzym-substrát na volný enzym a produkt je mnohonásobně větší, než kterákoliv z níže uvedených reakcí. Produkt je z reakce stále odčerpáván, tedy tato reakce je nevratná. Protože inhibitor obsazuje část molekul enzymu, pro vytvoření komplexu enzym-substrát je tedy k dispozici jen málo molekul volného enzymu. Z tohoto důvodu je reakce pomalá. Podobně lze uvažovat i v případě méně pevně vázaného inhibitoru (KI je číselně velká), který je ale přítomen ve stejné koncentraci jako substrát. Ani v tomto případě nelze předpokládat významnější ovlivnění rychlosti reakce. Ovšem za situace, kdy substrátu bude mnohem více, jak inhibitoru lze reálně předpokládat, že počet interakcí enzymu se substrátem bude mnohem větší, než enzymu s inhibitorem (viz srážková teorie). V takovém případě poměr ES : EI poroste, stejně tak i reakční rychlost. Při dostatečně vysoké koncentraci substrátu by pak měla být koncentrace komplexu enzym-inhibitor velice malá. V takovém případě bude rychlost reakce prakticky stejná, jako v nepřítomnosti inhibitoru.
V uvedené rovnici označuje [I] koncentraci inhibitoru a KI je disociační konstanta komplexu enzym-inhibitor. Při grafickém znázornění závislosti rychlosti na koncentraci substrátu při konstantní koncentraci inhibitoru (vyjádření podle Lineweavera a Burka) lze zjistit, že se přímky protínají na ose y. Protože je na ose y vynesena reakční rychlost (1/v), lze odvodit, že při nekonečně vysoké koncentraci substrátu (1/S = 0) je rychlost reakce stejná, jako v nepřítomnosti inhibitoru. Ovšem průsečík přímek s osou x se mění, pokud je inhibitor přítomen. Označíme-li KM jako Michaelisovu konstantu pro reakci bez přítomnosti inhibitoru a KM´ jako Michaelisovu konstantu pro reakci v přítomnosti inhibitoru, pak je zřejmé, že kompetitivní inhibitor zvyšuje zdánlivou Michaelisovu konstantu (KM´) pro substrát.
Protože KM je vlastně koncentrace substrátu v okamžiku, kdy koncentrace volného enzymu je právě rovna koncentraci molekul enzymu vázaných do komplexu enzym-substrát (ES), je tedy i dostupné poměrně velké množství molekul enzymu pro vytvoření komplexu enzym-inhibitor. Právě v tomto okamžiku je také rychlost reakce rovna polovině maximální rychlosti dané reakce. S přihlédnutím k předchozím rovnicím je jasné, že v přítomnosti kompetitivního inhibitoru určuje zdánlivou Michaelisovu konstantu člen v závorce.
Z rovnic je zřejmé, že zdánlivou Michaelisovu konstantu lze vypočítat z Michaelisovy konstanty odvozené z reakce bez přítomnosti kompetitivního inhibitoru. Takto vypočítanou KM lze pak použít do předchozí rovnice a při znalosti koncentrace inhibitoru lze vypočítat zdánlivou Michaelisovu konstantu pro systém enzym - substrát - kompetitivní inhibitor. Hodnoty KI jsou tabelované pro celou řadu analogů substrátů. Nejvyšší stupeň inhibice budou vyvolávat při nízké koncentraci inhibitory s nejnižšími hodnotami KI.
Výpočet lze ukázat na následujícím příkladu. Polovina maximální rychlosti enzymové reakce (Vmax/2) byla dosažena při koncentraci substrátu 1 . 10-4 M. KM bez přítomnosti inhibitoru je tedy 10-4 M. Byl přidán kompetitivní inhibitor v takovém množství, aby jeho výsledná koncentrace byla 2 . 10-3 M. Disociační konstanta komplexu enzym-inhibitor (KI) je 10-3 M. Vypočítaná zdánlivá Michaelisova konstanta reakce je pak rovna 3 . 10-4 M a následně vypočítaná rychlost reakce po přídavku inhibitoru je v = Vmax/4.
Vratná nekompetitivní inhibice
Při nekompetitivní inhibici se inhibitor váže na jiné místo, než je vazebné místo pro substrát. Ve většině případů ani není inhibitor strukturně substrátu podobný. Vratné nekompetitivní inhibitory mohou vytvářet tři možné cesty vedoucí ke štěpení substrátu na produkt. Enzym se totiž může nacházet v komplexu se substrátem (ES), dále pak v komplexu s inhibitorem (EI) a také v komplexu se substrátem i inhibitorem (EIS). Přitom je možné, aby se substrát navázal jak na samotný enzym, tak i na komplex enzymu s inhibitorem. Stejně tak může produkt vznikat štěpením substrátu z obou komplexů - ES i EIS.
Komplex EIS se však štěpí mnohem pomaleji než komplex ES. Ve výsledku dojde ke zpomalení reakce, nemůže však dojít k jejímu úplnému zastavení. Pokud má substrát stejnou afinitu k volnému enzymu jako k enzymu s navázaným inhibitorem, pak inhibitor neovlivňuje afinitu enzymu k substrátu. V takovém případě tento nekompetitivní inhibitor neovlivňuje Michaelisovu konstantu reakce, avšak zpomaluje rychlost reakce. Na následujícím grafu je zakreslena modelová situace, kdy vazbou inhibitoru na enzym nedochází k významnějšímu ovlivnění konformace jeho vazebného místa pro substrát.
Při tomto typu inhibice nelze zvýšením koncentrace substrátu působení inhibitoru eliminovat. Maximální rychlost reakce v přítomnosti nekompetitivního inhibitoru lze vypočítat podle vztahu na následující tabuli.
Nevratná nekompetitivní inhibice
Mnohé těžké kovy (Ag+, Hg2+, Cd2+ …), oxidační činidla, jódacetamid a mnohé další látky snižují enzymovou aktivitu. Tyto látky nemají žádnou strukturní podobnost s molekulou substrátu a jejich inhibiční účinek nelze odstranit pouhým zvyšováním koncentrace substrátu. Nemusí se však jednat vždy jen o jednoduché sloučeniny. Jsou známy případy velkých a složitých proteinových molekul, které podobný efekt vykazují a dokážou prakticky nevratně inaktivovat enzym. Jejich vazba na enzym je natolik pevná, že takto vytvořený komplex enzym-inhibitor jen obtížně zpětně disociuje na volný enzym a volný inhibitor. Mnohé z těchto proteinových inhibitorů svojí velikostí zabraňují přístupu molekuly substrátu k vazebnému místu, i když se samy do tohoto místa přímo nevážou. Vazebné místo pro inhibitor může být poblíž vazebného místa pro substrát, ale velikost molekuly inhibitoru toto vazebné místo pro substrát prostě překryje.
Příkladem mohou být bílkovinné inhibitory obsažené v sojových bobech nebo v syrovém vaječném bílku. Jejich působením dochází ke snížení počtu aktivních molekul proteáz, jako je pepsin nebo trypsin (část těchto molekul se díky vazbě na inhibitor enzymaticky neprojevuje, i když jsou v trávenině přítomny). Dokonce i sekret ze slinivky obsahuje bílkovinu, která působí jako inhibitor na pepsin. Sekrece takové látky má své fyziologické opodstatnění, protože trávenina odcházející ze žaludku je bohatá na aktivní pepsin a není žádoucí, aby tento působil na sliznici dvanácterníku do doby, než dojde k úpravě pH tráveniny a tím k vyřazení enzymové aktivity pepsinu. Podobný případ je na úrovni imunitního systému. Tělo člověka dokáže produkovat specifické protilátky, které inaktivují enzymy, které by se mohly dostat do tělních tekutin. Tato skutečnost například brání využití enzymů k léčbě podávaných nitrožilně. Obranný systém jejich aktivitu prostě zlikviduje mechanismem inhibice.
Mnohé z těchto inhibitorů se vážou na postranní řetězce aminokyselin v molekule enzymu takovým způsobem, že významně změní prostorové uspořádání aktivního centra enzymu. Pokud je tato vazba velice pevná (například vytváří se pevné kovalentní vazby), je takový enzym prakticky vyřazen ze svého účinku. Náprava v organismu je pak možná jen vytvořením nových molekul enzymu. Pokud se jedná o enzym zásadního významu, může mít působení takového inhibitoru až fatální důsledky (často se pak označují jako buněčné jedy).
Související články
Regulace enzymové aktivity - biochemie
Odkazy
Při zpracovávání textů a grafické stránky článků byly využity podklady z odborné literatury a internetu. Převzaté obrázky byly graficky upraveny pro potřeby tohoto webu. Kreslené obrázky podléhají autorským právům. Seznam použité literatury naleznete zde.