Flavinadenindinukleotid, flavinmononukleotid, FAD, FADH, FMN, flavinové koenzymy
Flavinové koenzymy
Flavinové koenzymy jsou odvozeny od riboflavinu
Redukované koenzymy NADH a NADPH mají vysoký redukční potenciál, a proto jsou schopné redukovat další látky. Význam tohoto poznatku se zvýšil v okamžiku, kdy bylo prokázáno, že anaerobní dehydrogenázy nejsou schopné přenášet protony a elektrony přímo na kyslík. Alternativou pro buňku je, aby byly přeneseny na jinou vhodnou sloučeninu. Tuto funkci plní velice dobře flavinové koenzymy, jednak flavinmononukleotid (FMN) a flavinadenindinukleotid (FAD). Flavinové koenzymy obsahují jako redoxně aktivní skupinu flavin (izoalloxazin), který může přijmout až 2 elektrony a 2 protony. Přitom standardní potenciál zůstává za fyziologických podmínek (při pH = 7) stále dostatečně záporný (-0,13 V), což stačí k tomu, aby mohly být elektrony předávány na další vhodnou sloučeninu.
Základem obou flavinových koenzymů je riboflavin, také označovaný jako vitamín B2. Tento vitamín je z chemického hlediska vlastně alloxazinový derivát, na pteridinový kruh je připojen benzenový kruh. Postranním řetězcem je pětiuhlíkový alkohol ribitol.
Biochemicky aktivním koenzymem se riboflavin stává až po fosforylaci na pátém uhlíku ribitolu. Takto fosforylovaný riboflavin se již neoznačuje jako vitamín, ale jako flavinmononukleotid.
Historie objevování
Riboflavin byl izolován již v roce 1879 z mléčné syrovátky jako látka se specifickým žlutým zbarvením. Tuto zelenkavě fluoreskující látku v následujícím období izolovala celá řada chemiků ze slepičích vajec, z masa a také z moči. Díky intenzivní žluté barvě byly tyto vyizolované látky označovány jako flaviny. Později se prokázalo, že se jednalo vždy buď o FMN nebo o FAD. Strukturu riboflavinu objasnil v roce 1933 Richard Kuhn se spolupracovníky, přičemž na získání přibližně 30 mg čistého vitamínu spotřebovali zhruba 10.000 vajec. V roce 1935 jej pak synteticky připravil Paul Karrer.
Úloha riboflavinu v procesu biologické oxidace byla vlastně odhalena jako důsledek zvýšeného zájmu biochemiků o pochopení a objasnění mechanismu buněčného dýchání. Již ve 20tých letech prováděl Otto Warburg pokusy k objasnění úlohy sloučenin obsahujících železo a vykazující oxidačně-redukční vlastnosti v procesu biologické oxidace. Jeho pokusy s oxidací glukózo-6-fosfátu v erytrocytech v přítomnosti methylenové modře potvrdily nezastupitelnou úlohu enzymu (v té době ještě neidentifikovaného) a také jakéhosi koenzymu. Tento koenzym byl později identifikován jako NADPH. Při těchto pokusech byl také potvrzen účinek „žlutého enzymu“ v procesu biologické respirace (v této době nebyl ještě riboflavin jako koenzym objeven, žlutý enzym byl chápán jako jedna látka). Otto Warburg také později vyslovil předpoklad, že za biologickou aktivitou žlutého enzymu je pigment flavinového typu a především jeho schopnost opakované oxidace a redukce.
V roce 1938 se podařilo Axelu Theorellovi prokázat, že původní žlutý enzym obsahuje flavinový koenzym FMN (riboflavin-5´-fosfát), který je vlastně za žlutou barvu „starého žlutého enzymu“ odpovědný. Pokusy s použitím EDTA později prokázaly jeho úlohu při přenosu vodíku v systému oxidačně-redukčních reakcí.
Později byla formulována koncepce dýchacího řetězce a úloha nikotinamidových a flavinových koenzymů jako kaskádových přenašečů vodíku. Také byla objasněna i jejich role při syntéze nových sloučenin v buňce, především však jejich nezastupitelná úloha v citrátovém cyklu.
Struktura flavinových nukleotidů
Jak již bylo zmíněno, flavinové koenzymy se odvozují od riboflavinu. Po fosforylaci se získá riboflavin-5‘-fosfát, který se označuje jako flavinmononukleotid (FMN). Označení není úplně přesné, protože se nejedná o nukleotid v pravém slova smyslu (nejedná se o N-glykosid ribózafosfátu), ale o derivát ribitolu. Protože se však označení i zkratka obecně vžily, je toto označení používáno i nadále. V následujících vzorcích obou koenzymů je žlutě vyznačena ta část molekuly, která je odpovědná za přenos protonů a elektronů.
Strukturně složitějším je druhý z flavinových koenzymů, flavinadenindinukleotid (FAD), který je častější součástí flavoproteinů. Podobně jako u nikotinamidových koenzymů jsou i v tomto případě adenozinmonofosfát a riboflavin-5´-fosfát vázány pyrofosfátovou vazbou. Ani v tomto případě není označení dinukleotid úplně přesné. Stejně jako v případě FMN je však z důvodů všeobecného používání akceptováno.
Oxidovaná a redukovaná forma flavinových koenzymů se liší absorpčními spektry. Této skutečnosti se využívá při sledování redukce těchto koenzymů optickými metodami.
Mechanismus působení
Mechanismus reakcí katalyzovaných flaviny je často obtížné stanovit, protože flavinové koenzymy mohou katalyzovat reakce probíhající jak iontovým mechanismem (dvouelektronové reakce), tak i mechanismem radikálovým (jednoelektronové reakce).
Izoalloxazinový systém funguje jako reverzibilní redoxní systém, vodíky se vážou na dusíky N1 a N5 (ve starších učebnicích bylo používáno jiné číslování a tyto učebnice uvádějí N1 a N10. V současné době je číslování alloxazinového heterocyklu upraveno). Bílkovinná část enzymu je odpovědná za přenos vodíku na koenzym. Aby mohl enzym dále plnit svoji katalytickou roli, musí být koenzym opětovně oxidován. V tomto případě se tak děje na stejné molekule enzymu, nejčastěji v součinnosti s dalším enzymovým systémem. Například v případě dýchacího řetězce je propojen se zvláštní bílkovinou obsahující železo a síru ve formě kovových komplexů, tato struktura je pak schopna odebrat protony a elektrony z FADH2 a přenést je na ubichinon (viz dýchací řetězec). Podobně jako u nikotinamidových koenzymů se ani v případě FAD na přenosu vodíku nepodílí část molekuly tvořená adenozinfosfátem.
Stejně jako u nikotinamidových koenzymů lze hydrogenační reakce i v případě flavinových koenzymů odvozovat od hypotetického hydridového iontu, který se chová jako nukleofilní činidlo a je schopen se nejen navázat na oxidovaný koenzym a tím ho redukovat, ale také se případně od redukovaného koenzymu odštěpit. Pravděpodobný mechanismus vazby hydridového iontu je znázorněn na následujícím schématu. Hydridový iont se podle této teorie váže na dusík v poloze 5, proton pak na dusík v poloze 1. Tímto mechanismem by bylo možné vysvětlit oxidaci alkoholů, aminů, ketonů a redukovaných pyridinových nukleotidů (nikotinamidových koenzymů).
Uvedený přenos hydridového iontu je však v buňce podstatně méně pravděpodobný, než přenos protonu a elektronového páru. Hydridový iont má mnohem větší rozměr než proton, který je tak mnohem pohyblivější a snadněji přístupný k vytvoření chemické vazby. Navíc předpokládaný přenos hydridového iontu ne zcela vysvětluje mechanismy některých reakcí spojených s tvorbou semichinonového radikálu. Také pokusy provedené s 5-deazaflavinem sice potvrdily přímý přenos vodíku z NADH případně NADPH na dusík flavinu v poloze 5, ale nedokazují mechanismus s účastí hydridového iontu. Tento mechanismus je možný, přenos hydridového iontu je však v živých systémech spíše výjimečnou reakcí.
Také postupný přenos dvou vodíkových atomů byl jednou z předpokládaných variant redukce flavinů. Jako meziprodukty takové reakce se však musí tvořit radikály jak z flavinu, tak i z oxidovaného substrátu. Zatímco radikály z flavinů se vytváří ochotně a jsou za určitých podmínek dokonce stabilnější než oxidovaná nebo redukovaná forma flavinu, vytváření radikálů z alkoholů nebo aminů je z pohledu chemie živé buňky spíše v teoretické rovině.
V současnosti je přijímána také teorie hydrogenace vodíkem formulovaná G. Hamiltonem. Svoji roli v tomto mechanismu sehrává uhlík v poloze 4a a dusík v poloze 5, protože oba tyto atomy vytváří Schiffovu bázi, která osciluje mezi dvěma stavy. Dusík v pozici 5 flavinu musí být redukovaný. Pro podpoření této hypotézy byl oxidovaný flavin částečně redukován siřičitanem za vzniku vazby mezi dusíkem v pozici 5 a sírou (na následujícím schématu je redukce tohoto atomu dusíku vyznačena klasicky vazbou s vodíkem). Podle této teorie dochází k interakci mezi atomem kyslíku hydroxylové skupiny alkoholu (obecně oxidovaného substrátu) a uhlíkem v pozici 4a, přičemž dochází k tomu, že se proton vymaní z vlivu kyslíku a dostává se pod vliv atomu dusíku v poloze 1. Z důvodů vyšší elektronové hustoty na atomu dusíku N1 dochází k zachycení protonu a následnému vytvoření vazby mezi dusíkem N1 a volným protonem. Tento elektronový posun způsobí zvýšení parciálního kladného náboje na uhlíku 10a a to nahrává tendenci začlenit elektronový pár z vazby mezi kyslíkem alkoholu a uhlíkem v pozici 4a do aromatického kruhu (rezonanční efekt). Po rozpadu aduktu se naplno projeví elektronegativita kyslíku, který si přitáhne elektronový pár z vazby mezi uhlíkem a vodíkem, což vede k uvolnění protonu do prostředí a vzniku aldehydické skupiny.
Produktem reakce je redukovaný flavin a aldehyd. Ke stejnému výsledku by vedl i přenos hydridového iontu od atomu uhlíku alkoholu. Jak bylo ale popsáno výše, vodík se ve skutečnosti odštěpuje od uhlíku ve formě protonu a ne jako hydridový iont. Fakticky tedy oba vodíky z alkoholu (od kyslíku i od uhlíku) disociují ve formě protonů, přičemž v okamžiku rozpadu aduktu se elektrony přenáší ve formě elektronového páru na aromatický kruh flavinu.
S přihlédnutím k výše uvedeným skutečnostem a k velikosti hydridového iontu pak G. Hamilton odvodil, že dehydrogenace ve většině případů probíhá mechanismem přenosu protonu. Následně byl tento mechanismus potvrzen při použití D-chloralaninu jako výchozího substrátu u modelové reakce katalyzované oxidázou D-aminokyselin. Produktem této reakce byl chlorpyruvát, ačkoliv za přirozených anaerobních podmínek vzniká pyruvát a chlorid amonný (jako ionty, v živé buňce jsou metabolizovány odděleně).
Schéma redukce flavinů dvojicí protonů a elektronů, jak je v současné době chápána, lze znázornit podle následujícího schématu. Je třeba si však uvědomit, že atak jak dusíku v poloze 5, tak i v poloze 1 probíhá prakticky současně a předkládané rozkreslení na dvě fáze je pouze z důvodů větší názornosti a přehlednosti. Ovšem v případech jednoelektronového přenosu probíhá právě krok směřující k tvorbě semichinonového radikálu a redukce se odehrává pouze na dusíku v pozici 5.
Z hlediska působení jsou oba flavinové koenzymy srovnatelné. Na rozdíl od nikotinamidových koenzymů vznikají při redukci flavinů semichinonové radikály, proto musí být buňka před jejich nepříznivým účinkem chráněna (tyto radikály jsou podstatně reaktivnější, než například radikály v chinon/chinolovém systému). Jako účinná a přitom jednoduchá se ukazuje forma pevné vazby koenzymu na bílkovinu enzymu. Oba flavinové koenzymy jsou na enzym vázány jako prostetické skupiny. Někdy je vazba tak pevná, že ji nelze rozštěpit ani při významnější změně pH nebo působením činidel srážejících bílkoviny. Například v případě sukcinátdehydrogenázy se jedná prakticky o plnohodnotnou kovalentní vazbu. Ochranu tak přebírá molekula enzymu. Příkladem může být enzym se dvěma katalytickými centry. V prvním působí jako koenzym FAD, přičemž probíhá radikálový přenos jednoho vodíku za vzniku semichinonu, v těsné blízkosti pak působí jako koenzym komplex železa a síry. Atom železa pak elektron přebírá a tím eliminuje účinek semichinonového radikálu. Vše se přitom odehrává na stejné molekule enzymu.
Na druhou stranu je možnost tvorby semichononového radikálu pro buňku v určitých případech přínosná, protože taková variabilita umožňuje flavinovým koenzymům přenášet 1 nebo 2 elektrony. Tím se stávají flavinové koenzymy univerzálními spojkami mezi jednoelektronovými a dvouelektronovými transportními systémy.
Stabilita flavinových radikálů
Jednou z charakteristických vlastností flavinů je jejich schopnost přijmout jeden elektron za vzniku semichinonového radikálu.
Rovnováha reakce uvedené na předchozím obrázku není sice závislá na pH, ale protože všechny 3 formy flavinu mají různé hodnoty pKa, zdánlivé rovnovážné konstanty sjednocující součet oxidované, redukované a radikálové formy se mění v závislosti na kolísání pH. Podíl radikálů je při nízkém nebo vysokém pH mnohem větší, než při pH kolem hodnoty 7.
Nenabité flavinové radikály jsou zbarveny modře (maximální absorbance při 580 nm), protonizovaný radikál v poloze N-1 nebo disociovaný z polohy N-5 způsobí zbarvení do červena (maximální absorbance při 470 nm). Obě formy radikálů se vyskytují v komplexech s enzymy. Byla vyslovena hypotéza, že enzymy vytvářející červeně zbarvené radikály obsahují v aktivním centru funkční skupinu, která vytváří silnou vodíkovou vazbu s protonem v pozici N-5. Dochází ke zvýšení bazicity dusíku v poloze 1, což vyvolá jeho protonizaci a flavinový koenzym přejde do stavu kationt - radikálu.
Pokud enzym váže flavinový radikál silněji, než oxidovanou nebo redukovanou formu, pak redukce flavinu probíhá ve dvou jednoelektronových fázích. U takových bílkovin se mohou hodnoty Eo´ pro každou fázi značně lišit.
Při studiu prostorového uspořádání molekul flavinů (jednotlivých forem) bylo zjištěno, že zatímco v případě semichinonového radikálu a oxidované formy leží atomy kruhového skeletu prakticky v jedné rovině (plochá konformace), v případě redukované formy dochází k zalomení na úhel přibližně 144°. Tato změna tvaru molekuly má velký význam při přenosu vodíku mezi aktivními centry enzymů (přenos z jedné látky na jinou).
Flaviny vytváří komplexy s kovy
Přítomnost určitých iontů kovů v molekulách některých flavoproteinů naznačuje, že tyto ionty hrají nějakou roli v mechanismu působení enzymu. Postupně bylo prokázáno, že v mnoha případech jsou tyto ionty vázány bezprostředně na flavinový koenzym. Kov interaguje s atomem dusíku v poloze 5 a s atomem kyslíku vázaného na atom uhlíku v poloze 4.
Pokud iont kovu nese více jak jeden kladný náboj (často se jedná o dvojmocný kationt), pak se tok elektronů mezi flavinem a substrátem může odehrávat prostřednictvím iontu kovu. Typickým příkladem takové reakce je působení enzymu xanthinoxidázy za spolupůsobení iontů molybdenu. Jiným příkladem jsou flavoproteiny obsahující navíc komplexy železa a síry, jako například NADH-dehydrogenáza a sukcinátdehydrogenáza. Oba tyto mitochondriální enzymy přenáší elektrony (za katalytického působení právě atomů železa) na systém cytochromů v dýchacím řetězci. Laktátdehydrogenáza je příkladem složitějšího enzymu, který obsahuje vedle flavinového koenzymu a železosirného komplexu i hem. Flavinový koenzym i hem jsou vázány na různé polypeptidové řetězce molekuly enzymu. Enzym si elektrony předává z redukovaného flavinu přes atom železa na hem. Akceptorem elektronu je pak v dalším kroku cytochrom c.
Reakce flavinových koenzymů s kyslíkem
Samotný redukovaný riboflavin (dihydroriboflavin) je schopný reagovat s kyslíkem za vzniku peroxidu. Tatáž reakce katalyzovaná enzymem (za účasti flavinového koenzymu) však probíhá mnohonásobně rychleji. Mechanismus reakce se nejčastěji popisuje s účastí atomů uhlíků v poloze 4a a 10a. Kyslík však může interagovat i s jinými atomy v kruhu.
Flavinové koenzymy v těchto reakcích často vystupují ve formě radikálů, které nakonec vedou k tvorbě superoxidového aniontu. Pro další reakci je nutná přítomnost superoxiddismutázy. Vliv tohoto enzymu v procesu reoxidace flavinových koenzymů je však v porovnání s jinými mechanismy probíhajícími v buňce velmi malý.
Flavinové koenzymy se účastní celé řady reakcí
Enzymy obsahující jako prostetickou skupinu flavinové koenzymy katalyzují velice rozmanité reakce. Katalyzují oxidaci poloacetalů na laktony (např. D-glukózy na lakton D-glukonové kyseliny), alkoholů a aldehydy, aminů na iminy, umožňují tvorbu dvojných vazeb v řetězcích karboxylových kyselin (oxidace mastných kyselin), reoxidaci redukovaných nikotinamidových koenzymů v dýchacím řetězci a také oxidaci dithiolů na disulfidy.
Flaviny patří ke sloučeninám, které jsou schopny fungovat jako receptory světelného záření. Účastní se některých reakcí spojených s bioluminiscencí a také některých atypických fotoreakcí u rostlin.
Související články
Flavinmononukleotid - rejstřík
Flavinadenindinukleotid - rejstřík
Nikotinamidové koenzymy - biochemie
Odkazy
Při zpracovávání textů a grafické stránky článků byly využity podklady z odborné literatury a internetu. Převzaté obrázky byly graficky upraveny pro potřeby tohoto webu. Kreslené obrázky podléhají autorským právům. Seznam použité literatury naleznete zde.