NAD, NADH, NADP, NADPH, nikotinamidové koenzymy, nikotinové koenzymy
Nikotinamidové koenzymy
Nikotinamidové koenzymy jsou odvozeny od nikotinové kyseliny
Nikotinamidové koenzymy (označované často jako pyridinové nukleotidy) jsou odvozeny od kyseliny nikotinové, přesněji od amidu kyseliny nikotinové (nikotinamid), označované také jako vitamín B3. Kyselina nikotinová byla získána poprvé v roce 1867 oxidací nikotinu. Z biologického materiálu byla izolována poprvé v letech 1911 až 1912 z kvasnic a rýžových otrub Funkem a Sudzuki (nezávisle na sobě). Její biologický význam byl zdokumentován teprve až při studiu přeměny cukru na alkohol. V roce 1937 byla poprvé použita při léčení pelagry. Jako vitamín byla označena později. Kyselina nikotinová může být zastoupena tryptofanem (přeměňuje se na kyselinu nikotinovou), tryptofan však dosahuje jen asi 2 %ní vitamínové účinnosti kyseliny nikotinové.
V koenzymech je pyridinový kruh vázaný N-glykosidicky s ribózou a tato vazba je možná pouze s pyridinovým kationtem (atom dusíku je protonizovaný, nese tedy kladný náboj). Dříve používaný název difosfopyridinnukleotid je nesprávný, protože se nejedná o nukleotid difosfopyridinu, ale o dinukleotid, jehož jednou bází je pyridinový derivát (nikotinamid) a druhou bází je purin (adenin). Toto platí pro koenzym NAD i NADP.
Oba fosforylované nukleotidy (nikotinamidnukleotidfosfát a adenosinmonofosfát) jsou v molekule obou koenzymů navzájem vázány prostřednictvím svých fosfátových skupin situovaných v poloze 6 ribózy (vytvoří se pyrofosfátová vazba).
Historie objevování
Historicky se jedná o nejdéle známé koenzymy. Jejich objevení bylo logickým vyústěním poznatku popsaného Eduardem Buchnerem již v roce 1899, že extrakt připravený rozetřením kvasničných buněk v písku a přefiltrováním (tedy po odstranění všech živých buněk) je dále schopen přeměňovat cukr na alkohol. Tento přelomový objev odstartoval éru moderní biochemie.
Již v roce 1904 rozdělili Arthur Harden a William Young ultrafiltrací Buchnerův kvasničný extrakt a zjistili, že takto zahuštěný materiál ztrácí schopnost přeměňovat cukr na alkohol a oxid uhličitý. Odvodili tedy, že proces je závislý na nějaké nízkomolekulární látce, která byla schopna během ultrafiltrace projít přes filtrační membránu a zůstala v odfiltrovaném roztoku. Pokud odfiltrovaný roztok zahustili a opětovně jej přidali k zahuštěnému materiálu, reakce se znovu rozběhla. Stejně tak po přidání původního kvasničného extraktu, který však byl před tím tepelně ošetřen (tepelně byly zdenaturovány všechny přítomné bílkoviny). O 2 roky později získali koferment, který označili jako kozymázu. Z dnešního pohledu se jednalo o směs anorganického fosfátu, thiamindifosfátu a NAD. Tento nízkomolekulární podíl později studoval Hans von Euler-Chelpin, kterému se v roce 1931 podařilo vyizolovat čistou kodehydrázu I (později označovanou jako difosfopyridinnukleotid - DPN+, nyní označovaný jako koenzym NAD+).
Ve stejné době studoval Otto Warburg se spolupracovníky oxidativní procesy v erytrocytech a zjistili, že pro úplnou přeměnu glukózy na oxid uhličitý je potřeba právě látka izolovaná Hansem von Euler-Chelpinem. Ovšem ve filtrátu se objevila i velice podobná nízkomolekulární látka, kterou označili jako kodehydrázu II (později označovanou jako trifosfopyridinnukleotid TPN+, nyní označovaný jako koenzym NADP+). Tým kolem Otto Warburga také popsal velkou strukturní a funkční podobnost kodehydrázy I a kodehydrázy II. Vyslovili předpoklad, že obě sloučeniny vystupují jako přenašeče vodíku mechanismem střídavé redukce a oxidace pyridinového cyklu. Také dokázali, že oba koenzymy mohou být redukovány nejen cestou enzymatické katalýzy, ale také nefermentativně působením Na2S2O4. Úplná struktura NAD a NADP byla objasněna v roce 1935.
Později bylo dokázáno, že redukované formy koenzymů jsou poměrně dobře stabilní na vzduchu a snadno se zpětně oxidují působením žlutého fermentu.
Struktura nikotinamidových nukleotidů
Jak již bylo uvedeno, molekula koenzymu je tvořena dvěma nukleotidy spojenými navzájem prostřednictvím fosfátových skupin. Podobně jako v mnoha dalších koenzymech tvoří základ adenosin, který se však vůbec nepodílí na procesu přenosu vodíku nebo elektronů. Vzhledem ke kladnému náboji, který nese pyridinová část molekuly koenzymů, se používají zkratky NAD+ případně NADP+. Kladný index by však neměl vést k domněnce, že molekula koenzymu je kladně nabitá, protože celkový náboj molekuly je díky fosfátovým skupinám záporný. Používání indexu + je pouze dohodnutým pravidlem a zvýrazňuje oxidovanou formu koenzymu. Pokud je v textu použito označení bez zvýraznění kladného náboje, mluví se v takovém případě o koenzymu jako takovém bez rozlišení oxidovaného nebo redukovaného stavu.
Strukturně se tyto dva koenzymy liší pouze navázáním fosfátové skupiny na třetí uhlík ribózy v adenosinu. Přítomnost této fosfátové skupiny není pro přenos vodíku a elektronů vůbec podstatná, protože je skupina prostorově příliš vzdálená od místa, kde dochází k vazbě protonu a obou elektronů (pyridinové jádro). Ovšem negativně se chovající fosfátová skupina způsobí jiné prostorové uspořádání celé molekuly NADP, a proto se NAD a NADP vážou k rozdílným skupinám enzymů. Na obrázcích je žlutě vyznačeno pyridinové jádro, které je místem vazby hydridového iontu.
Funkce obou koenzymů spočívá v reverzibilní vazbě vodíku, přitom se pyridinový kruh redukuje a dusík ztrácí svůj kladný náboj. Současně také kruh ztrácí aromatický charakter a vzniklé 2 dvojné vazby dávají kruhu jiné chemické vlastnosti. Právě tyto změněné vlastnosti bývají příčinou toho, že vytvořený redukovaný NADH bývá vázán do aktivního centra enzymu mnohem menší silou než NAD+ a snadno se z tohoto enzymového centra uvolňuje. K jinému enzymu má pak redukovaná forma koenzymu větší afinitu ve srovnání s NAD+ (oxidovaná forma koenzymu) a tím se dosáhne potřebného přenosu vodíku případně elektronů na jiný substrát. Jak je tedy patrné, koenzymy fungují jako přenašeče vodíku a elektronů z jednoho substrátu na druhý, přičemž na své cestě mohou (ale nemusí) využít rozdílné enzymy. Proto se v dřívější době někdy používalo označení kosubstráty (toto označení se však neujalo, dnes se používá označení koenzymy, i když v tomto případě neodpovídá přesně definici pro koenzym). Označení kosubstráty má význam u typicky disociabilních koenzymů, protože reagují jako druhý substrát, který s vlastním substrátem reaguje ve stechiometrických poměrech, tj. mol na mol, a tedy ne vyloženě katalyticky. V následné reakci (obvykle ji katalyzuje jiná bílkovina) může hydrogenovaný koenzym zase přijatý vodík odevzdat. Také v této reakci vystupuje koenzym jako druhý substrát, který reaguje stechiometricky. Katalytické působení koenzymu se tedy uskutečňuje teprve spřažením s oběma enzymy v enzymovém systému (přesněji řečeno, spřažením dvou dílčích enzymatických reakcí, přičemž při jedné dochází k redukci koenzymu a ve druhé k jeho opětovné oxidaci). Podobně to platí i pro NADP+.
Mechanismus působení
Při biologické oxidaci se ze substrátu odštěpují 2 vodíky, přičemž koenzym je schopen vázat jen jeden, a to ještě pouze ve formě hydridového iontu. K jeho vzniku je potřeba spoluúčast nukleofilního činidla, což v převážné většině případů obstarává vhodná funkční skupina v aktivním centru enzymu. Názorně je to ukázáno v článku glykolýza na případu enzymu glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (krok 5). Vodík, který se připojuje na pyridinový kruh je ve formě hydridového iontu (správněji protonu a dvou elektronů) a tedy nese záporný náboj. Elektron navíc vyvolá elektronové přeskupení v pyridinovém kruhu, způsobí eliminaci kladného náboje na dusíku a zpřístupní uhlík v pozici 4 k ataku protonem. Na následujícím obrázku je na zobrazení (B) znázorněno elektronové přeskupení v pyridinovém jádře. Hydridový iont je zde pro větší přehlednost znázorněn jako proton a dva samostatné elektrony, aby bylo dobře patrné, na kterém atomu se tyto elektrony uplatňují. Na zobrazení (A) jsou oba elektrony hydridového iontu zdůrazněny dvěma tečkami. Druhý odštěpený vodík ze substrátu se vyskytuje jako volný proton (je znázorněn fialovou barvou). Proto se v reakcích při označení redukované formy koenzymu uvádí zápis NADH + H+.
Redukované nikotinamidové koenzymy ochotně odevzdávají získaný hydridový iont v systému oxidačně redukčních reakcí, protože kruh může dosáhnout bez přičleněného vodíku (modře zbarvený) stabilnější uspořádání elektronů. V následné reakci dochází k opětovné oxidaci koenzymu, přičemž druhý substrát se redukuje. Nikotinamidové koenzymy ochotně odevzdávají svůj hydridový iont jiným molekulám stejně, jako např. ATP ochotně přenáší zbytek kyseliny fosforečné. V obou těchto případech je přenos doprovázen uvolněním poměrně značného množství Gibbsovy energie.
Opětovná oxidace NADH na NAD+ a NADPH na NADP+ je možná ferrokyanidem, chinony nebo riboflavinem. Není možná pomocí H2O2 nebo O2.
Vazba hydridového iontu je stereospecifická
Adice hydridového iontu na NAD+ je stereospecifická a probíhá výhradně na straně Re nikotinamidového kruhu a poskytuje tak atom vodíku s konfigurací pro-R.
V pokusech prováděných s deuteriem bylo prokázáno, že deuteriový iont se může k pyridinovému jádru přiblížit pouze shora (pokud se vychází ze skutečnosti, že kruh leží plošně na bílkovině). O tom, která strana kruhu je reakci přístupná pak rozhodují vazebná místa pro ribózafosfát a amidovou skupinu na povrchu bílkoviny. Byla přijata dohoda, že strana, ze které se váže hydridový iont při dehydrogenaci ethanolu působením alkoholdehydrogenázy nebo při dehydrogenaci laktátu laktátdehydrogenázou se označuje jako strana A. Naopak strana, ze které se váže hydridový iont při působení glukózadehydrogenázy nebo triózafosfátdehydrogenázy se označuje jako strana B.
Tato stereospecifita umožňuje buňce velice efektivní spolupráci dvou enzymů, které právě nikotinamidový nukleotid k přenosu vodíku využívají. Pokud je totiž na pyridinový kruh v pozici 4 navázaný pouze jeden vodík, leží v rovině kruhu. Jakmile se na pyridinový kruh naváže hydridový iont odštěpený z molekuly substrátu 1 (např. ze strany A), původní vodík se „vytlačí“ na stranu B. Následně se může působením druhého enzymu vodík v pozici B odštěpit a přenést na substrát 2. Tím se ale navázaný vodík (z pozice A) dostane do pozice ležící v rovině kruhu a ze strany A se pak může opět navázat nový vodík z další molekuly substrátu 1.
NAD a NADP jsou v buňce využívány k rozdílným účelům
Proč buňka využívá pro přenos vodíku strukturálně 2 velice podobné koenzymy a nepoužívá jen jeden? Především proto, že může nezávisle regulovat dva typy zcela odlišných reakcí související s přenosem protonu a elektronů. NADH je významným přenašečem protonu a elektronů v případě reakcí směřujících k zisku energie v podobě ATP cestou biologické oxidace molekul z potravy. Naproti tomu NADPH je koenzym, který se uplatňuje především v anabolických reakcích, tedy při biosyntéze energeticky bohatých molekul. Tvorba NADH z NAD+ a NADPH z NADP+ probíhá různými cestami, které jsou nezávisle regulovány a tak může buňka nastavit dodávání elektronů pro oba protichůdné účely. V buňce je udržován vysoký poměr NAD+ k NADH, zatímco poměr NADP+ k NADPH je naopak velmi nízký. To znamená, že v buňce je velké množství NAD+ jako oxidačního činidla a velké množství NADPH jako činidla redukčního. Současně je v buňce mnohem více molekul NAD, než NADP. Proto má buňka k dispozici enzym NADP-transhydrogenázu, která umožní oxidaci NADPH na NADP+, přičemž akceptorem vodíku je v tomto případě právě NAD+. Jinými slovy, buňka si je schopna v případě nutnosti vyrobit NADH z NADPH, tedy upřednostnit systém získávání ATP (energie) v dýchacím řetězci před biosyntézou.
Související články
Nikotinamidadenindinukleotid - rejstřík
Nikotinamidadenindinukleotidfosfát - rejstřík
Flavinové koenzymy - biochemie
Odkazy
Při zpracovávání textů a grafické stránky článků byly využity podklady z odborné literatury a internetu. Převzaté obrázky byly graficky upraveny pro potřeby tohoto webu. Kreslené obrázky podléhají autorským právům. Seznam použité literatury naleznete zde.