Enzymová aktivita, aktivní centrum, vazebné centrum, alosterie, allosterie, inhibice
Regulace enzymové aktivity
Aktivní centra enzymů
Jakmile se začaly studovat enzymové reakce mimo buňku, bylo nutné nějakým způsobem popsat děje, kterými substrát prochází při přeměně na produkt a především pak interakce mezi substrátem a enzymem. Zpočátku byla přijímána Fischerova teorie o zámku a klíči, to znamená, že substrát svou prostorovou strukturou přesně zapadá do aktivního centra enzymu, které je neměnné a má prostorové uspořádání přesně odpovídající substrátu. Jinými slovy, substrát do aktivního centra zapadá jako klíč do zámku. I když se dnes představa o pevné (a neměnné) struktuře aktivního centra považuje za překonanou, stále se používá k vysvětlení některých vlastností enzymu a k pochopení kinetiky jednoduché křivky saturace enzymu substrátem.
V dnešní době se k objasnění procesů probíhajících v aktivním centru enzymu využívá Koshlandova teorie o přizpůsobení se. Podstatou této teorie je flexibilita oblasti aktivního centra. Zatímco Fischerova teorie vychází z předpokladu předem vytvarovaného aktivního centra, do kterého substrát přesně zapadne, v Koschlandově teorii se vychází z předpokladu, že substrát vyvolá nejprve konformační změnu enzymu. Ta uvede zbytky aminokyselin nebo jiné funkční skupiny na enzymu do správného prostorového uspořádání ve vztahu k vazbě substrátu, katalýze nebo k obojímu. Přitom může dojít k obnažení nebo naopak k zanoření jiných zbytků aminokyselin na molekule enzymu.
Při hledání důkazů pro potvrzení této teorie byla snaha o prokázání vyvolaných konformačních změn enzymu. Podařilo se to u kreatinkinázy a fosfoglukokinázy. Při konformační změně navozené vazbou substrátu může enzym nejprve projít konformační změnou (I) a potom naváže substrát (II). V jiném případě se může nejprve navázat substrát (III) a teprve potom dojde ke konformační změně (IV). Zcela logicky lze také předpokládat, že oba popsané pochody mohou probíhat současně, přes případnou izomerii až ke konečné konformační změně (V).
V současné době je již potvrzeno, že rozhodující úlohu sehrávají funkční skupiny (obvykle určité boční řetězce některých aminokyselin) a jejich prostorová orientace. I když mohou být tyto rozhodující aminokyseliny poměrně hodně od sebe vzdáleny z hlediska primární struktury (tj. pořadí aminokyselin v peptidickém řetězci), z hlediska terciární struktury mohou být situovány do těsné blízkosti. Pokrok v sekvenování peptidických řetězců a studium prostorového uspořádání enzymových molekul potvrzují, že se často opakují stejné, nebo velice podobné sekvence v aktivních centrech studovaných enzymů. Lze proto předpokládat, že počet mechanismů vedoucích ke štěpení chemických vazeb, není příliš velký.
Biologická aktivita enzymů je výsledkem fyzikálních interakcí
Biologické vlastnosti enzymu (obecně proteinu) jsou důsledkem fyzikálních interakcí se substrátem. To znamená, že musí dojít k určité vazbě mezi enzymem a substrátem. V některých případech je tato vazba velice pevná, v jiných má jen velice krátké trvání. V každém případě však vazba umožňuje, že si enzym „vybírá“ z mnoha tisíců molekul jen některé, mnohdy jen jednu jedinou. Vazba tedy umožňuje specifitu (také selektivitu) enzymu k substrátu.
Schopnost enzymu se selektivně a s velkou afinitou vázat na konkrétní substrát je důsledkem vytváření vodíkových vazeb, iontových vazeb, van der Waalsových sil a také příznivých hydrofobních interakcí. I když jsou tyto vazby poměrně slabé, jejich velký počet zajistí účelnou interakci. Velký počet těchto vazeb může vzniknout právě (a jen) tehdy, když povrchové uspořádání aktivního centra enzymu kopíruje povrchové uspořádání molekuly substrátu (model zámku a klíče).
Aktivní centrum (také označované jako vazebné centrum) enzymu si lze představit jako dutinu v povrchu enzymu, která je vytvořena určitým uspořádáním aminokyselin, přičemž právě jejich boční řetězce hrají rozhodující roli v enzymové katalýze. Zajímavé je, že aminokyseliny nemusí v peptidickém řetězci spolu sousedit, mohou být dokonce od sebe v takovém řetězci poměrně vzdáleny. O všem rozhoduje terciární struktura enzymu, tzn. způsob sbalení peptidického řetězce. Tímto způsobem se mohou potřebné aminokyseliny dostat do těsné blízkosti a vytvořit vazebné místo na povrchu molekuly enzymu.
Na první pohled se může zdát, že ostatní aminokyseliny (ty, které se nepodílejí na vytvoření vazebného místa) nejsou tak důležité. Je třeba si však uvědomit, že tyto aminokyseliny vytváří jakousi kostru nebo hmotu, která má nějaký povrch a na které se utváří vazebné místo. Přestože tyto aminokyseliny nemají se substrátem přímý kontakt, ovlivňují chemické a fyzikální chování vazebného místa (zejména tvar dutiny a také „vystrčení“ rozhodujících funkčních skupin žádoucím způsobem do dutiny). I malá změna v pořadí aminokyselin v peptidickém řetězci skrytém uvnitř molekuly enzymu často změní jeho trojrozměrnou strukturu natolik, že není schopen potřebným způsobem substrát vázat a tím i provést reakci. Takovým způsobem lze vysvětlit některá onemocnění, jejichž podstatou je mutace, následná záměna některé aminokyseliny za jinou v peptidickém řetězci, jiné prostorové uspořádání molekuly enzymu a tím i ztráta jeho aktivity.
Alosterický efekt
V roce 1963 doplnil Koshlandovu teorii J. Monod s tím, že zavedl pojem alosterického efektu. Podstata tohoto jevu spočívá v navázání specifické látky (alosterického efektoru) na specifické alosterické místo enzymu a tím se indikuje změna prostorového uspořádání aktivního centra enzymu. Toto alosterické místo je umístěno v jiné části molekuly enzymu, než je aktivní centrum, kde probíhá katalytická přeměna substrátu. Když se na takový enzym do alosterického místa naváže efektor působící jako aktivátor, převádí enzym na aktivní formu a ten je pak schopen katalyzovat příslušnou reakci. Naproti tomu, pokud se na enzym naváže inhibitor, vyvolá to změnu vedoucí k inaktivaci enzymu a potom taková reakce neproběhne.
Regulační enzym se nachází obvykle na počátku posloupnosti biochemických reakcí a obvykle produkt poslední reakce současně působí jako alosterický efektor tohoto regulačního enzymu. Tím ovlivňuje průběh celé metabolické dráhy. Velice často bývá takový regulační enzym umístěn v metabolické dráze i na místě významného rozdvojení, tzn., že produkt reakce může být současně substrátem pro dvě další, zcela rozdílné, metabolické dráhy.
Inhibice enzymu
Důležitou roli v regulaci enzymové aktivity sehrávají poměrně malé, ale specifické látky, označované jako inhibitory. Inhibice spočívá ve vazbě inhibitoru na molekulu enzymu tak, že nedojde k žádanému přeuspořádání vazebného místa pro substrát, nedojde tedy k dostatečně pevnému připojení substrátu na enzym a toto nedokonalé přizpůsobení se aktivního centra enzymu neumožní, aby reakce proběhla.
Inhibice může být buď vratným, nebo nevratným procesem. Při nevratné inhibici dochází k tak pevnému připojení inhibitoru na molekulu enzymu, že zpětná disociace prakticky neprobíhá nebo jen velice pomalu. Příkladem takové nevratné inhibice může být vazba paralyzujících jedů na acetylcholinesterázu, což je jeden z rozhodujících enzymů pro vedení nervových vzruchů. Jedním z takových jedů je diizopropylfluorofosfát. Tato sloučenina se kovalentně váže na hydroxylovou skupinu serinu lokalizovaného v aktivním centru enzymu. Tím, že se tato sloučenina naváže na aktivní centrum, znemožní navázání substrátu. Enzym se stane nefunkčním.
Podobně se chová i jódacetamid, který nevratně inhibuje enzymy vazbou na cysteinový zbytek v jejich aktivních centrech. V tomto případě dochází k inhibici nejčastěji z toho důvodu, že obsazená sulfhydrylová skupina ztrácí schopnost vyvolávat potřebné elektronové přesuny v molekule substrátu a tím nedochází k oslabování chemických vazeb, které jsou předmětem katalytické přeměny.
Naopak při vratné inhibici dochází k ustavování rovnováhy mezi komplexem enzym-inhibitor a volným enzymem velice rychle. Jednodušším případem vratné inhibice je inhibice enzymu konkurenčním inhibitorem (kompetitivní inhibice). Klasická kompetitivní inhibice se odehrává na místě pro vazbu substrátu, tzn. v katalytickém centru enzymu. To znamená, že inhibitor se váže na stejné místo, jako substrát a vlastně obsazuje aktivní centrum pro možnost navázání substrátu. Jinými slovy, není možné, aby se současně na molekulu enzymu mohl navázat inhibitor a také substrát. Konkurenční inhibitor snižuje rychlost katalytické reakce jako důsledek obsazení aktivního centra enzymu, nebo také snižuje počet molekul enzymu, které jsou schopny efektivně vázat substrát. Typickým příkladem konkurenčního inhibitoru je působení malonátu na sukcinátdehydrogenázu. Tento enzym odštěpuje ze sukcinátu 2 vodíky (viz citrátový cyklus, krok 6). Malonát po navázání na sukcinátdehydrogenázu nemůže být dehydrogenován, protože neexistuje žádný způsob, jak odstranit byť jen jeden atom vodíku z jediného α-uhlíku malonátu (musel by vzniknout pětimocný uhlík). Jedinou reakcí, kterou v takovém okamžiku může enzym uskutečnit, je opětovný rozklad komplexu sukcinátdehydrogenáza-malonát. Pokud malonát obsadí aktivní centrum sukcinátdehydrogenázy, vyřadí tuto molekulu enzymu z přeměny sukcinátu a počet vzniklých molekul fumarátu se snižuje.
Dalším příkladem působení konkurenčního inhibitoru je přeměna 1,3-bisfosfoglycerátu na 2,3-bisfosfoglycerát. Tuto izomeraci katalyzuje bisfosfoglycerátmutáza, která je inhibována již malými koncentracemi 2,3-bisfosfoglycerátu, tedy produktu reakce, kterou sama katalyzuje. Jedná se o typický příklad konkurenční inhibice produktem reakce (viz glykolýza, krok 7), jehož strukturní podobnost se substrátem je hodně velká. 2,3-bisfosfoglycerát je natolik strukturně podobný 1,3-bisfosfoglycerátu, že zůstává v aktivním centru enzymu ještě relativně dlouho a brání tak navázání 1,3-bisfosfoglycerátu.
V případě vratné inhibice nekonkurenčním inhibitorem (nekompetitivní inhibice) dochází k navázání substrátu a inhibitoru ve stejném čase. Jinými slovy, i když je na enzym nekonkurenční inhibitor navázán, nebrání vazbě substrátu na enzym. Podstata účinku nekonkurenčního inhibitoru tedy nespočívá ve snižování počtu molekul enzymu schopného vázat do aktivního centra substrát, ale ve snižování čísla přeměny. Ve skutečnosti však mechanismus působení takového inhibitoru bývá obvykle mnohem složitější a spočívá jak ve snížení čísla přeměny, tak i v ovlivnění prostorového uspořádání aktivního centra enzymu a tím i snížení schopnosti substrátu se na aktivní centrum enzymu efektivně navázat.
Aktivita enzymu může být inhibována i vlivem vzájemných interakcí mezi jednotlivými subjednotkami oligomerního enzymu. Takový typ inhibice se označuje jako alosterická inhibice a má značný význam ve fyziologických procesech. Zvláštností tohoto typu inhibice je to, že závislost rychlosti reakce na koncentraci substrátu není klasicky hyperbolická (jako podle Michaelise a Mentenové), ale má sigmoidní průběh. Vazba substrátu na takový enzym má podobný průběh, jako například vazba kyslíku na hemoglobin. To znamená, že jednotlivé podjednotky enzymu vzájemně kooperují, jedno aktivní centrum enzymu ovlivňuje činnost dalšího aktivního centra téže molekuly enzymu. Kromě toho může být aktivita alosterických enzymů ovlivňována i dalšími specifickými sloučeninami, které se vážou na jiné místo enzymu (než je aktivní centrum), podobně, jako ovlivňuje vazbu kyslíku na hemoglobin bisfosfoglycerát, proton a CO2.
Související články
Enzymová kinetika při inhibici - biochemie
Odkazy
Při zpracovávání textů a grafické stránky článků byly využity podklady z odborné literatury a internetu. Převzaté obrázky byly graficky upraveny pro potřeby tohoto webu. Kreslené obrázky podléhají autorským právům. Seznam použité literatury naleznete zde.