Krebsův cyklus, citrátový cyklus, cyklus trikarbonových kyselin, cyklus kyseliny citrónové
Citrátový cyklus
Význam citrátového cyklu pro buňku
Hlavní funkcí citrátového cyklu je působit jako konečná metabolická dráha pro oxidaci sacharidů, lipidů a proteinů. Je tomu tak proto, že glukóza, mastné kyseliny a téměř všechny základní aminokyseliny jsou metabolizovány buď na acetyl-CoA, nebo na některý z meziproduktů citrátového cyklu. Citrátový cyklus tedy vytváří hotovost meziproduktů (pool), které se buď využívají pro výstavbu nové buněčné hmoty, nebo se dále odbourávají, aby se získala energie.
Na následujícím schématu je pro větší přehlednost znázorněn směr všech reakcí pouze jedním směrem, od oxalacetátu směrem k malátu. Některé reakce jsou sice vratné, ale celkově probíhá cyklus vyznačeným směrem. Označení enzymů je provedeno čísly na šipkách a jejich názvy jsou uvedeny v dalším textu.
Jak už sám název napovídá, jedná se o cyklus a pro jeho zdárný průběh musí být tedy k dispozici dostatečné množství všech substrátů a meziproduktů. Pokud z jakéhokoliv důvodu využije buňka některý z meziproduktů tohoto cyklu pro jiné reakce (například pro tvorbu glukózy), začne se koncentrace příslušného meziproduktu snižovat a cyklus by směřoval k zastavení. Proto má buňka vytvořený celý systém doprovodných reakcí, jejichž úkolem je neustále cyklus zásobovat potřebným množstvím všech meziproduktů, výchozího substrátu případně regenerovaných koenzymů. Zároveň to buňce umožňuje operativně vytvářet potřebné substráty pro biosyntetické pochody z jiných sloučenin. Příkladem může být využití aminokyselin pro potřeby citrátového cyklu (ve schématu jsou pro větší přehlednost znázorněny jen vybrané meziprodukty cyklu).
Konečnými produkty aerobního metabolismu (z pohledu získávání energie) jsou v podstatě oxid uhličitý a voda. Oxid uhličitý vzniká v citrátovém cyklu při odbourávání karboxylových kyselin, voda však vzniká až v dýchacím řetězci. V citrátovém cyklu se totiž neuplatňuje kyslík, ale je v něm 2x vázána voda, působením příslušných koenzymů je pak odnímán vodík a jeho reakce s kyslíkem probíhá až v dýchacím řetězci. Přesto však může citrátový cyklus probíhat pouze za aerobních podmínek. To proto, že je nutné odstraňovat NADH a FADH2 (což se děje právě v dýchacím řetězci).
Historie objevování citrátového cyklu
Jedním z prvních, který se zabýval oxidací organických sloučenin v živých organismech, byl Torsten Thunberg. Do roku 1920 popsal více než 60 organických sloučenin podléhajících oxidaci v živé tkáni, přičemž velkou pozornost u něj vzbudily acetát, laktát, sukcinát, fumarát, malát, citrát a glutamát. Pokusil se popsat oxidaci acetátu v cyklu, přičemž předpokládal kondenzaci dvou molekul acetátu za vzniku sukcinátu.
V roce 1932 začal systematicky zkoumat oxidaci některých vybraných sloučenin s využitím řezů různých tkání Hans Krebs. Pozoroval, že především acetát, citrát, fumarát a sukcinát významně ovlivňovaly rychlost oxidačních procesů. V roce 1935 poukázal Albert Szent Györgyi na schopnost některých oxokyselin (ketokyselin) stimulovat proces dýchání v případech, kdy současně probíhá oxidace jiného substrátu, jako například glukózy. Když pak v roce 1937 objasnili Carl Martius a Franz Knoop úlohu ketoglutarátu (oxoglutarátu) jako produktu oxidační přeměny citrátu, byly vytvořeny všechny potřebné podmínky pro odhalení mechanismu, jak dochází k oxidaci některých složek přijímané potravy.
V roce 1937 byl cyklus kyseliny citrónové popsán Krebsem a Johnsonem. Následující objevy týkající se úlohy acetyl-CoA, procesů dehydrogenace a zejména pak výsledky pokusů prováděných s radioizotopy již správnost popsaného cyklu jen potvrdily. Na počest svého objevitele bývá cyklus citrónové kyseliny někdy označován i jako (velký) Krebsův cyklus nebo také jako cyklus trikarbonových kyselin.
Citrátový cyklus je křižovatkou metabolických drah
Citrátový cyklus má velký význam jako spojovací článek mezi různými způsoby odbourávání a syntézy. Zvláštní postavení mezi intermediárními metabolity mají acetát (ve formě acetyl-CoA), pyruvát, oxoglutarát, sukcinát a oxalacetát. K nim se také řadí NADH a NADPH jako zdroje aktivního vodíku a také ATP (jako hotovost chemické energie). Specifickým metabolitem cyklu je citrát, v jeho podobě je vyváděn acetyl-CoA z mitochondrií do cytosolu buňky, kde se pak stává výchozím substrátem pro syntézu mastných kyselin.
Velký význam má především napojení metabolismu většiny aminokyselin na některý z meziproduktů cyklu. Prostřednictvím citrátového cyklu se dokonce mohou uplatnit i atomy uhlíku pocházející z tuků při opětovné syntéze glukózy (glukoneogeneze). Protože se však v průběhu cyklu ztrácí 2 atomy uhlíku formou dekarboxylace, není úplná syntéza glukózy z tuků možná. Aby mohla tato metabolická dráha probíhat, musí být do cyklu v mitochondriích průběžně doplňován oxalacetát, například z již zmiňovaných aminokyselin.
Savci včetně člověka nedokážou z acetyl-CoA tvořit cukry (tedy ani glykogen). U baktérií a rostlin to však umožňuje cyklus glyoxalové kyseliny, jehož konečným metabolitem je sukcinát. Jak je zřejmé, sukcinát již úplnou syntézu cukrů umožňuje.
Citrátový cyklus probíhá v osmi krocích
Kondenzací acetyl-CoA se čtyřuhlíkatou sloučeninou (oxalacetát) vzniká šestiuhlíkatá sloučenina (citrát), která se sledem reakcí opět mění (regeneruje) na stejnou čtyřuhlíkatou sloučeninu (oxalacetát), přičemž se kruh uzavírá. Nutno ovšem podotknout, že po každé obrátce cyklu zůstávají v molekule oxalacetátu pouze 2 výchozí atomy uhlíku, zbývající 2 jsou uvolněny ve formě oxidu uhličitého (a jsou nahrazeny uhlíky pocházejícími z acetyl-CoA). Protože je molekula sukcinátu symetrická, dochází ve druhé obrátce cyklu již k uvolňování uhlíku ve formě oxidu uhličitého, který může (ale nemusí) pocházet z acetyl-CoA (toto tvrzení se ale vztahuje pouze k molekule acetyl-CoA, který vstoupil do cyklu v předcházející obrátce).
Izomer citrátu podléhá oxidační dekarboxylaci, přičemž vzniká pětiuhlíkatá sloučenina (oxoglutarát). Následnou oxidační dekarboxylací vzniká čtyřuhlíkatá sloučenina (sukcinát). Dalším sledem reakcí dochází k regeneraci oxalacetátu. Do cyklu vstupují dva atomy uhlíku ve formě acetyl-CoA a dva atomy uhlíku se z cyklu uvolňují ve formě oxidu uhličitého. Stupeň redukce je v případě acetylové skupiny mnohem vyšší, než v případě oxidu uhličitého. Proto v cyklu probíhají oxidačně redukční reakce. Celkem v cyklu proběhnou 4 takové reakce. 3 hydridové ionty (3 atomy vodíku celkem se 6 elektrony) se přenáší na NAD+ a jeden pár atomů vodíku (2 elektrony) se přenáší na FAD.
Tvorba citrátu - krok 1
Pro syntézu citrátu je třeba aktivovaná kyselina octová (ve formě acetyl-CoA) a oxalacetát. Oxoskupina oxalacetátu reaguje v obměněné aldolové kondenzaci s methylovou skupinou acetyl-CoA a reakci katalyzuje kondenzační enzym citrátsyntáza (1). Nová vazba se vytváří mezi methylovým uhlíkem acetyl-CoA a karbonylovým uhlíkem oxalacetátu.
Při této kondenzační reakci se nejprve vytvoří citroyl-CoA, který je však málo stabilní, a proto ihned následuje hydrolýza thioesterové vazby CoA. Přitom dochází ke značné ztrátě energie ve formě tepla, což zapříčiní nevratný průběh tohoto reakčního kroku. Reakce je tedy za fyziologických podmínek nevratná. Pro větší názornost je v následujících obrázcích acetylová skupina označena žlutě.
Izomerace citrátu - krok 2
V dalším kroku je citrát přeměňován na izocitrát enzymem akonitáthydratázou (2). Přestože je kyselina citrónová symetrickou sloučeninou, probíhá přeměna v izocitrónovou kyselinu stereospecificky, a to na tom atomu uhlíku, který pochází z oxalacetátu (hydroxyl se přesouvá na uhlík pocházející z oxalacetátu a ne na uhlík pocházející z acetyl-CoA).
Reakce probíhá přes karbeniový kationt, který je společným mezistupněm mezi všemi třemi metabolity. Enzym ustavuje rovnováhu mezi substráty v poměru citrát 89 % : cis-akonitát 3 % : izocitrát 8 %. Hlavním cílem tohoto reakčního kroku je vytvořit sekundární alkoholickou skupinu, která snadno oxiduje na oxoskupinu. Obě reakce jsou vratné.
Reakci inhibuje fluoracetát, který se nachází například v listech rostliny Dichapetalum cymosum. Přibližně hodinu po pozření vzroste koncentrace citrátu v mnoha orgánech těla až desetinásobně. Během poměrně krátké doby nastává smrt. Účinek fluoracetátu spočívá v tom, že ve formě fluroacetyl-CoA kondenzuje s oxalacetátem za vzniku fluorcitrátu, který se na akonitázu váže mnohem pevněji, než samotný citrát. Tím blokuje aktivní centrum enzymu a dochází ke hromadění citrátu. LD50 fluoracetátu je pro krysy 0,2 mg/kg živé hmotnosti. Zajímavostí je, že zatímco fluoracetát je toxický, jeho analog - difluoracetát - toxický není. Samotný fluoracetát však na buňky toxicky nepůsobí, ale jeho toxicita se projeví až po kondenzaci na fluorcitrát.
První dekarboxylace - krok 3
V tomto reakčním kroku se nejprve využije výhodné pozice hydroxylu na druhém uhlíku. Po přeměně alkoholické skupiny na oxoskupinu dojde k významnému přerozdělení elektronového oblaku na třetím uhlíku, v důsledku toho se i oslabí vazba na příslušný karboxyl.
Izocitrát se tedy nejprve přeměňuje dehydrogenací na oxalsukcinát, který však zřejmě zůstává vázán v aktivním centru enzymu a následně dochází k jeho dekarboxylaci na 2-oxoglutarát (dříve označovaný jako α-ketoglutarát). Reakci katalyzuje izocitrátdehydrogenáza (3). Významnou roli v průběhu této reakce sehrávají ionty Mn2+ případně Mg2+.
V buňkách byly prokázány 2 rozdílné izocitrátdehydrogenázy. Enzym využívající jako koenzym NADP+ je lokalizován jak v mitochondriích, tak i v cytosolu buňky. Tato izocitrátdehydrogenáza poskytuje redukční ekvivalenty především pro syntetické pochody. Druhý enzym využívá jako koenzym NAD+ a je lokalizován pouze v matrix mitochondrií. Je aktivován ADP (naopak vyšší koncentrace ATP jej inhibuje) a vše nasvědčuje tomu, že buňka tuto izocitrátdehydrogenázu využívá především pro napojení na dýchací řetězec, tedy pro pochody směřující k zisku energie. Oba kroky této reakce jsou vratné.
Tvorba oxoglutarátu je důležitým regulačním místem cyklu. Jakmile začne vzrůstat koncentrace NADH, dochází k soutěžení o aktivní místo enzymu mezi NAD+ a NADH, přičemž NADH z důvodu vyšší koncentrace blokuje navázání NAD+ na příslušné místo enzymu. Tím dochází i k blokování další přeměny na oxoglutarát. Naopak, vyšší spotřeba energie (ATP) v buňce vede ke zvyšování koncentrace ADP a tento stimuluje izocitrátdehydrogenázu k vyšší aktivitě (allosterický efekt, enzym ochotněji na sebe váže izocitrát).
Druhá dekarboxylace - krok 4
2-oxoglutarát je významným intermediárním metabolitem a v cyklu podléhá oxidativní dekarboxylaci podobným způsobem, jako je tomu v případě oxidativní dekarboxylace pyruvátu. Reakci katalyzuje 2-oxoglutarátdehydrogenáza (4, dříve označovaná jako α-ketoglutarátdehydrogenáza). Jedná se o podobný enzymový komplex (a vyžadující i identické kofaktory), jako je pyruvátdehydrogenázový komplex.
Reakce vede k tvorbě sukcinyl-CoA, což je thioester obsahující makroergickou vazbu. Rovnováha reakce je silně posunuta ve prospěch sukcinyl-CoA, a proto lze tuto reakci za fyziologických podmínek považovat za nevratnou. Tento jednosměrný tok navíc umocňuje průběžné odčerpávání vzniklého NADH do dýchacího řetězce. Reakci inhibuje arsenitan a způsobuje tak hromadění 2-oxoglutarátu.
Enzymový komplex 2-oxoglutarátdehydrogenázy je vlastně tvořen 3 enzymy. Jádro komplexu tvoří transsukcinyláza, na ni je připojena z jedné strany 2-oxoglutarátdehydrogenáza a z druhé strany dihydrolipoyldehydrogenáza. Komplex využívá jako koenzymy thiamindifosfát, lipoamid, CoA, FAD a NAD+.
Fosforylace na substrátové úrovni - krok 5
Sukcinyl-CoA se může využít buď pro biosyntetické reakce (tvorba krevního barviva) nebo se mění na sukcinát, přičemž energetický potenciál thioesterové vazby sukcinyl-CoA zůstává zachován ve formě chemické energie. Makroergická thioesterová vazba sukcinyl-CoA je energeticky natolik bohatá, že umožňuje spřažení s jinou reakcí, a tou je fosforylace GDP na GTP. Standardní změna Gibbsovy energie pro hydrolýzu sukcinyl-CoA (s přihlédnutím ke skutečným koncentračním poměrům reaktantů v mitochondriích) je přibližně 32 kJ/mol, pro tvorbu GTP asi 29 kJ/mol. Jedná se o jediný případ reakce v citrátovém cyklu, kdy vzniká makroergická fosfátová vazba na substrátové úrovni.
Reakci katalyzuje sukcinyl-CoA-syntetáza (5, také se označuje jako sukcinátthiokináza) a jedná se o vratnou reakci. Zbytek fosforečné kyseliny se nejprve váže na atom histidylového zbytku v aktivním centru enzymu. Vzniklý histidylfosfát má vysokou schopnost přenosu fosfátové skupiny na GDP. Fosfátová skupina GTP se následně snadno přenáší na ADP, tuto reakci katalyzuje nukleosiddifosfokináza. Není-li k dispozici dostatek ADP, GTP se přestane spotřebovávat a začne se hromadit, což vyvolá deficit GDP. Nedostatek GDP způsobí nárůst koncentrace sukcinyl-CoA, protože mu začne chybět reakční partner. Na vzrůstající koncentraci sukcinyl-CoA reaguje citrátsyntáza útlumem své aktivity (inhibice enzymu). V konečném důsledku se rychlost cyklu zpomalí a acetyl-CoA se začne využívat pro jiné reakce.
Přenos vodíku na flavoprotein - krok 6
V tomto kroku se sukcinát oxiduje na fumarát účinkem sukcinátdehydrogenázy (6). Akceptorem vodíku není jako v předešlých krocích NAD+, ale FAD. Důvodem je nižší hodnota volné energie, která nestačí pro redukci NAD+. Zatímco NAD+ působí v aktivním centru enzymů jako volný (nevázaný) koenzym, FAD je na sukcinátdehydrogenázu vázán kovalentní vazbou prostřednictvím histidinu. Vznikající fumarát má konfiguraci trans.
Enzym obsahuje 4 atomy železa a také 4 atomy síry. Jedná se o typ enzymu neobsahující hem a patří do skupiny bílkovin obsahujících nehemové železo. Enzym je specifický pro trans vodíkové atomy methylenového uhlíku v sukcinátu. Sukcinátdehydrogenáza je flavoprotein, který je současně zapojen i do dýchacího řetězce (proto je lokalizována v mitochondriální membráně) a je kompetitivně inhibována malonátem nebo oxalacetátem. Kyselina malonová vystupuje jako „falešný“ substrát, který se sice dokáže na enzym navázat, ale čistě z chemických důvodů nedokáže patřičným způsobem reagovat.
Sukcinát a z něho vzniklý fumarát jsou symetrické molekuly a proto nadále není acetylová skupina pocházející z acetyl-CoA značena žlutě (nelze již rozlišit, která část molekuly fumarátu pochází z acetyl-CoA, v následujících reakcích se obě poloviny molekuly chovají rovnocenně). Reakce je vratná.
Dehydratace - krok 7
Přeměna fumarátu na malát je slabě exergonickou reakcí, avšak vratnou. Rovnováha reakce je posunuta ve prospěch malátu, poměr mezi malátem a fumarátem je 82 : 18 (vyjádřeno v procentech). Reakci katalyzuje fumaráthydratáza (7).
Při této reakci opět vzniká výhodně umístěná hydroxylová skupina na druhém uhlíku, čímž se vytváří podmínky pro potřebný elektronový přesmyk (obdoba při vzniku 2-oxoglutarátu z izocitrátu).
Dehydrogenace malátu - krok 8
V posledním kroku citrátového cyklu se dehydrogenuje sekundární hydroxylová (alkoholická) skupina jablečné kyseliny (malátu), reakci katalyzuje malátdehydrogenáza (8) za spolupůsobení koenzymu NAD+. Produktem reakce je oxalacetát, výchozí substrát a startér předchozích popisovaných reakcí. Kruh se uzavírá a vytváří jednu obrátku citrátového cyklu.
Za standardních podmínek reakce prakticky neprobíhá, je výrazně posunuta ve prospěch malátu. Ovšem z důvodů neustálého odčerpávání oxalacetátu pro další obrátku cyklu a také NADH do dýchacího řetězce se udržuje koncentrace obou těchto látek na nízké úrovni a tím se termodynamicky reakce stává mírně výhodnou směrem k tvorbě oxalacetátu. Jakmile však vzroste koncentrace oxalacetátu, okamžitě se mění směr reakce ve prospěch malátu. Reakce je tedy snadno vratná, což má mimořádný význam například v procesu glukoneogeneze z laktátu.
Podobně jako v případě izocitrátdehydrogenázy existují i dvě rozdílné malátdehydrogenázy, které využívají jako koenzymy NAD+ nebo NADP+. NADP+ malátdehydrogenáza je aktivována vysokou koncentrací volného CoA a je inhibována vysokou koncentrací NADH. V okamžiku omezení procesu glykolýzy narůstá koncentrace volného CoA, a právě tato malátdehydrogenáza zajistí oxidaci malátu. Naproti tomu NAD+ malátdehydrogenáza zajišťuje přeměnu malátu na oxalacetát v okamžiku probíhající intenzívní glykolýzy a následné produkce acetyl-CoA. Výsledkem jejího působení je nárůst koncentrace oxalacetátu a akcelerace rychlosti citrátového cyklu. Tyto rozdílné malátdehydrogenázy zřejmě hrají v organismu důležitou roli při udržování potřebné koncentrace NADPH v cytoplasmě (je nutné pro zajištění biosyntetických pochodů).
Oxalacetát je konečným a současně i výchozím produktem
Pro hladký průběh citrátového cyklu je nezbytné, aby oxalacetátu bylo v každém okamžiku v mitochondrii dostatečné množství, nebo aby jeho koncentraci bylo možné rychle navýšit. Zcela nezastupitelnou roli v dodávce oxalacetátu hraje karboxylace pyruvátu. V současné době se ví, že pyruvátkarboxyláza je rozhodujícím enzymem, který zajišťuje dodávku potřebného oxalacetátu. Tento enzym je totiž allostericky aktivován acetyl-CoA. Jakmile stoupne koncentrace acetyl-CoA, dochází velice rychle k aktivaci pyruvátkarboxylázy a protože pyruvátu je k dispozici vždy dostatek, je tedy zajištěn i rychlý nárůst koncentrace oxalacetátu. Za normálních podmínek je koncentrace oxalacetátu v mitochondrii velice nízká (asi 2 . 10-7 až 4 . 10-7 M) a dosahuje počtu asi 20 až 40 molekul oxalacetátu v jedné mitochondrii. S ohledem na uvedené údaje je význam pyruvátkarboxylázy pro hladký průběh citrátového cyklu zcela nezastupitelný.
Úloha oxalacetátu je v citrátovém cyklu svým způsobem výjimečná. Jednak kondenzuje s acetyl-CoA na citrát v nevratné reakci (tedy je definitivně určen jeho další osud), ale je také součástí sledu vratných reakcí až po sukcinyl-CoA. A právě tento sled reakcí v obráceném směru umožňuje buňce provádět celou řadu biosyntetických pochodů i za méně příznivých podmínek (viz tvorba krevního barviva, metabolismus aminokyselin apod.). Termodynamicky jsou totiž tyto reakce velice výhodně nastaveny a výsledný směr reakcí je dán pouze koncentračními poměry mezi jednotlivými reaktanty daného reakčního kroku.
Příkladem může být situace, kdy v mitochondrii vzniká dostatek oxalacetátu (např. vysoká nabídka pyruvátu), ale současně je i vytvořena dostatečná zásoba ATP. Vysoká koncentrace ATP znamená nízkou koncentraci ADP, tedy není kam ukládat energii, kterou dýchací řetězec nabízí. Dýchací řetězec tedy snižuje výkon. Snížení výkonu dýchacího řetězce znamená nárůst koncentrace NADH produkovaného citrátovým cyklem. Zvýšená koncentrace NADH znamená inhibici enzymů izocitrátdehydrogenázy a 2-oxoglutarátdehydrogenázy, tedy omezení citrátového cyklu. Také ovšem dochází k inhibici pyruvátdehydrogenázového komplexu, tedy se omezuje přeměna pyruvátu na acetyl-CoA. Pyruvát se za těchto podmínek přeměňuje téměř kvantitativně na oxalacetát. Poměr mezi oxalacetátem a malátem se změní a reakce začne probíhat opačně ve prospěch tvorby malátu. Zvýšená koncentrace malátu vyvolá jeho transport přes mitochondriální membránu do cytosolu buňky, kde z něj vzniká cytosolový oxalacetát, z něj pak fosfoenolpyruvát a startuje se proces glukoneogeneze. Vzniká požadavek na dodávku ATP. Dýchací řetězec se rozbíhá a začíná spotřebovávat NADH a produkovat NAD+. V okamžiku, kdy klesne koncentrace ATP (zvýší se koncentrace ADP), citrátový cyklus okamžitě reaguje způsobem, ke kterému je v buňce předurčen a přednostně produkuje redukční ekvivalenty pro dýchací řetězec. Jak se cyklus rozbíhá a nabírá na rychlosti, koncentrace oxalacetátu klesá a rovnováha reakce mezi malátem a oxalacetátem se posouvá ve prospěch oxalacetátu. Sled reakcí pak jednoznačně probíhá opět ve směru znázorněném na úvodním schématu, tedy jako katabolický cyklus.
Energetická výtěžnost citrátového cyklu
Většina reakcí citrátového cyklu má hodnotu gibbsovy energie za standardních podmínek blízkou nule (kromě 3 reakcí), což v důsledku znamená poměrně citlivou regulaci celého cyklu jen díky změnám koncentrací jednotlivých meziproduktů. Záporná hodnota znamená samovolný průběh reakce, jedná se o exergonickou reakci (hodnoty ∆G0 v uvedeném přehledu se vztahují ke směru reakce zleva doprava). Na obrázku jsou oboustrannými šipkami znázorněny reakce, které jsou za fyziologických podmínek (s přihlédnutím ke skutečným koncentračním poměrům) snadno vratné.
Na dalším obrázku jsou pro větší názornost graficky znázorněny rozdíly v hodnotách standardní gibbsovy energie jednotlivých reakčních kroků. Jak je patrné, pokud není v prvním kroku spotřebováván oxalacetát (není zajištěna dodávka acetyl-CoA) reakce posledního kroku se prakticky otočí (ve prospěch malátu). Jakmile se však začne oxalacetát spotřebovávat, i poslední reakční krok se vlivem koncentračních změn dostane do mírně záporných hodnot a reakční rovnováha se posune ve prospěch oxalacetátu.
Výsledkem oxidace acetyl-CoA dehydrogenázami citrátového cyklu jsou 3 molekuly NADH a jedna molekula FADH2. Jejich redukční ekvivalenty jsou přenášeny dýchacím řetězcem a v průběhu přenosu se z 1 molekuly NADH vytvářejí 3 makroergické fosfátové vazby (esterifikace ADP na ATP procesem oxidativní fosforylace). Molekula FADH2 však poskytuje pouze 2 makroergické fosfátové vazby, protože tento koenzym přenáší své redukční ekvivalenty až na ubichinon a vynechává tak první krok oxidativní fosforylace. Další makroergická vazba vzniká v důsledku substrátové fosforylace přímo v citrátovém cyklu. Celkem se může vyprodukovat 12 makroergických vazeb na jednu obrátku cyklu.
Ve skutečnosti se vytvoří na jednu obrátku cyklu přibližně 10 molů ATP, protože z koncentračních důvodů se v mitochondriích při oxidaci 1 molu NADH vytvoří pouze 2,5 molu ATP a při oxidací 1 molu FADH2 jen 1,5 molu ATP (viz článek Dýchací řetězec).
Energetická bilance citrátového cyklu vykazuje jen malý pokles volné energie (∆G0 = -105 kJ/mol), což je způsobeno rozštěpením makroergické vazby acyl-CoA a dekarboxylacemi. Z termodynamického hlediska je tento malý rozdíl výhodný, protože to umožňuje udržovat všechny meziprodukty citrátového cyklu přibližně ve stejné koncentraci. Protože je však citrátový cyklus spřažen s reakcemi dýchacího řetězce, je celková energetická bilance podstatně jiná. Celkem se může uvolnit za standardních podmínek 905 kJ chemické energie, z toho přibližně 800 kJ přes dýchací řetězec. I z těchto čísel je patrné, že buňka získává energii především při tvorbě vody, nikoliv při produkci oxidu uhličitého. Část energie se projevuje ve formě tepla, které však organismus efektivně využívá pro udržování stálé tělesné teploty. Zbytek energie se ukládá ve formě chemické energie v podobě makroergických vazeb. Protože cyklus poskytuje výtěžek 12 makroergických vazeb (za standardních podmínek) a při uvažované energii vazby cca 30 kJ/mol to činí celkově asi 360 kJ, lze uvažovat s energetickou efektivností celého procesu přibližně 40 %.
Regulace citrátového cyklu
Citrátový cyklus je regulován několika mechanismy, přičemž každý z nich se uplatňuje za jiných podmínek. Hlavními faktory jsou rychlost přísunu acetylové skupiny ve formě acetyl-CoA (může být závislé na množství volného CoA), dostupnost oxalacetátu a rychlost oxidace NADH v dýchacím řetězci.
Acetyl-CoA stimuluje přeměnu pyruvátu v oxalacetát (allosterický efekt). Tímto způsobem podporuje tvorbu sloučeniny, která je nutná pro jeho vlastní přeměnu (kondenzační reakce). Při nedostatku pyruvátu se omezuje i produkce oxalacetátu a citrátový cyklus snižuje svoji aktivitu. Příkladem může být stav, kdy jaterní buňky metabolizují zvýšené množství alkoholu. Ethanol se přeměňuje na acetát, ale nemůže se přeměnit na oxalacetát. Vznikající acetát se nemůže uplatnit v citrátovém cyklu (nemá partnera pro kondenzační reakci), a proto se mění na ketonové látky (ty se sice mohou v citrátovém cyklu uplatnit, ale výrazně pomaleji). Podobná situace může nastat při metabolismu tuků za podmínek narušení přeměny cukru (například při diabetu).
Rychlost oxidačních kroků v cyklu je určena rychlostí oxidace NADH v dýchacím řetězci. Za určitých podmínek se může limitujícím faktorem stát dodávka kyslíku. Obvykle je ale rozhodující aktuální koncentrace ADP a také anorganického fosfátu. Jestliže je produkce ATP vyšší, než činí potřeba buňky, koncentrace ADP výrazně klesá a inhibuje se proces fosforylace. Současně vysoká koncentrace ATP omezuje procesy katabolismu cukrů a tuků (především inhibicí pyruvátdehydrogenázového komplexu). Je třeba mít na zřeteli skutečnost, že rychlost spřaženého dýchacího řetězce není limitována rychlostí přenosu elektronů, ale nedostatkem ADP. Jakmile poklesne koncentrace ATP (zvýší se tedy koncentrace ADP), dýchací řetězec zvýší rychlost a okamžitě spotřebovává i NADH.
Rychlost citrátového cyklu je ovlivňována především potřebou ATP (energie) v buňce, nabídkou výchozích substrátů (oxalacetátu a acetyl-CoA) a také aktivitou klíčových enzymů. Pokud se aktivuje proces glykolýzy nebo oxidace mastných kyselin, dochází i k aktivaci citrátového cyklu. Velkou roli hraje i obsah NADH. Současně je nutno mít na zřeteli úzkou provázanost s regulací aktivity pyruvátdehydrogenázy (9).
Prvním regulačním místem je kondenzace oxalacetátu s acetyl-CoA. ATP vystupuje v roli allosterického inhibitora enzymu citrátsyntázy (1) a jeho účinek spočívá ve zvýšení hodnoty KM pro acetyl-CoA. Se zvyšující se koncentrací ATP se snižuje afinita enzymu k acetyl-CoA, což v důsledku vede ke snížení produkce citrátu.
„Nejpomalejším“ enzymem cyklu je izocitrátdehydrogenáza (3), jejíž aktivita klesá se zvyšujícím se poměrem ATP/ADP. Vysoká koncentrace ATP způsobí inhibici tohoto enzymu, následně se začne zvyšovat koncentrace citrátu, který se pak přenáší přes mitochondriální membránu do cytosolu buňky. Zde začne inhibičně působit na aktivitu fosfofruktokinázy. Dochází ke snížení rychlosti glykolýzy a v konečném důsledku ke snížení produkce pyruvátu (a tím i oxalacetátu případně acetyl-CoA). Tento reakční krok je druhým regulačním místem cyklu. Navíc zvyšující se koncentrace NADH vede k vytěsňování NAD+ z aktivního místa enzymu, což vede ke snížení rychlosti tvorby 2-oxoglutarátu. Někteří autoři považují ovlivňování aktivity izocitrátdehydrogenázy za rozhodující bod celého systému regulace citrátového cyklu.
Dalším regulačním místem je ovlivňování aktivity 2-oxoglutarátdehydrogenázy (4). Enzym je inhibován zvyšující se koncentrací sukcinyl-CoA a také vzrůstající koncentrací NADH, tedy konečnými produkty vlastní reakce.
Podobně při zvyšování koncentrace NADH snižuje aktivitu i malátdehydrogenáza (8). Ovlivňování aktivity tohoto enzymu má však ve srovnání s výše uvedenými třemi regulačními místy méně významnou roli. Přesto z termodynamických důvodů má tento reakční krok velký význam při regulaci průběhu citrátového cyklu. Regulace v tomto případě spočívá především v koncentračních změnách malátu a oxalacetátu, čímž se významně ovlivňuje směr dané reakce.
Protože jsou meziprodukty citrátového cyklu současně i důležitými substráty nebo koncovými metabolity jiných metabolických drah, zaujímá citrátový cyklus rozhodující postavení v intermediárním metabolismu. Proto je výsledná rychlost reakcí citrátového cyklu také významně ovlivňována anaplerotickými reakcemi (reakce doplňující některé meziprodukty citrátového cyklu z jiných metabolických drah). Typickým příkladem může být doplňování 2-oxoglutarátu při transaminaci glutamátu nebo syntéza oxalacetátu z pyruvátu.
Související články
Termochemické zákony - biochemie
Nikotinamidové koenzymy - biochemie
Odkazy
Při zpracovávání textů a grafické stránky článků byly využity podklady z odborné literatury a internetu. Převzaté obrázky byly graficky upraveny pro potřeby tohoto webu. Kreslené obrázky podléhají autorským právům. Seznam použité literatury naleznete zde.